注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Sodium acetate -Acetic acid Buffer solutionMBHA Resin 0.3~0.8mmol/g, 100~200 mesh, 1% DVB齊墩果酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

Barbitone sodium-Hydrochloric acid Buffer solutionMalantide ≥97% (HPLC)齊墩果酸 97%

Borax-Hydrochloric acid Buffer solutionMastoparan-7 ≥97% (HPLC)麥冬皂苷D 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

Potassium chloride-Hydrochloric acid Buffer solutionMastoparan 17 ≥96.5%補(bǔ)骨脂素  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

Sodium citrate-Hydrochloric acid Buffer solutionDL-正亮氨酸 98%芍藥苷  ≥98% (HPLC)

Saturated picric acid Buffer solutionL-正纈氨酸 99%3,4-二羥基苯甲酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品, ≥97.0% (HPLC)

Xmol/L-Hydrochloric acid Buffer solutionN'-硝基-L-精氨酸 98%紫杉 98%

L-Oxalate Buffer solutionN-硝基-L-精氨酸甲酯 98%胡椒堿 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

Hank′s solutionL-正亮氨酸 99%植酸 90%,用于分子生物學(xué)

任氏液3-硝基-L-酪氨酸 98%植酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品

盧戈液神經(jīng)降壓素  ≥95% (HPLC)虎杖苷 分析標(biāo)準(zhǔn)品

TCEPBoc-D-精氨酸鹽酸鹽 BR虎杖苷 98%

Folin & Ciocalteu’s phel reagentFmoc-1-Nal-Wang resin 100-200mesh,Substitution 0.3-0.8mmol/g貝母素乙 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

GlycerineFmoc-2-Nal-Wang resin 100-200mesh,Substitution 0.3-0.8mmol/g鹽酸巴馬汀 分析標(biāo)準(zhǔn)品

1-ThioglycerolN-α-羰基苯氧基-D-精氨酸 98.0%人參三 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98

Disodium beta-glycerol phosphate pentahydrateN'-硝基-D-精氨酸 98%原阿片堿   98%

乙酯(Standard for GC,≥99.5%(GC))TBK1/NAK (D1B4) Rabbit mAbMetallothionein 3  金屬硫蛋白3抗體

己酸乙酯(Standard for GC,>99%(GC))AUP1 (D5M9Q) Rabbit mAbMetallothionein  金屬硫蛋白抗體

棕櫚酸乙酯(standard for GC,≥99%(GC))Asymmetric-Methyl-PABP1 (Arg455/Arg460) (C60A10) Rabbit mAbMetal ion transporter  擬南介金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體

異辛酸(Standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-NDRG1 (Ser330) AntibodyMet Enkephalin  甲硫氨酸腦啡肽抗體

乙胺(Standard for GC,>99.5%(GC))Sav1 AntibodyMESP1  心血管發(fā)育中胚層相關(guān)蛋白1抗體

乙二二乙(standard for GC,≥99.5%(GC))Brg1 (A52) AntibodyMesothelioma  間質(zhì)細(xì)胞蛋白抗體

乙二二甲(standard for GC,≥99.5%(GC),含0.01% BHT穩(wěn)定劑)Brg1 (A52) AntibodyMesothelin  間皮素抗體

乙二乙乙酸酯(Standard for GC,>99%(GC))Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb (Sepharose®Bead Conjugate)MEPE  細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化抗體

戊酸乙酯(standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-Connexin 43 (Ser368) AntibodyMEP1A/Meprin alpha/PPHA  苯甲酸肽解酶抗體

乙酸乙酯(Standard for GC,≥99.5%(GC))Connexin 43 AntibodyMEOX 2  間充質(zhì)同源盒蛋白2抗體
鼠疫耶爾森菌鼠疫桿菌PCR檢測(cè)試劑盒廠家內(nèi)皮素受體A抗體3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxide中文名：3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物別名：分子式：C7H4O3S2

內(nèi)皮細(xì)胞受體蛋白酪氨酸激酶A抗體（腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白4）5-Azacytidine中文名：5-氮胞苷別名：分子式：C8H12N4O5

酪氨酸蛋白激酶A4抗體Bathophenanthroline中文名：紅菲繞啉別名：分子式：C24H16N2

大腸埃希菌菌體蛋白抗體4'-Ami-3',5'-dichloroacetophene中文名：3',5'-二氯-4'-氨基苯乙酮?jiǎng)e名：分子式：C8H7Cl2

前列腺素E受體3抗體2-Ami-6-chloropurine中文名：2-氨基-6-氯嘌呤別名：分子式：C5H4ClN5
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。