注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
 Taq DNA PolymeraseBiological stain，生化試劑級N-CBZ-羥脯氨酸甲酯 95%

Hot Taq DNA PolymeraseBiological stain，生化試劑級3-羥基-9H-占噸-9-酮 98%

Hotstart Taq DNA Polymerase龍腦 55%L-亮氨 96%

Taq plus DNA Polymerase芐基酮 98%2-甲基-6-甲酸 98%

 Pfu DNA Polymerase3-二乙氨基酚 97%5-甲氧基-2-甲酸 97%

SP6 RNA Polymerase2-乙氧基-1-乙氧碳?；?1,2-二氫喹啉 99%L-苯氨酸叔丁酯鹽酸鹽 99%

T3 RNA Polymerase4-甲基-2-氧戊酸 98%N-叔丁氧羰基肌氨酸 98%

T7 RNA Polymerase苯酮酸 98%D-泛酸鈣 藥用級

T4 DNA Polymerase芐叉酮  >98.0%(GC)亞硫酸氫鈉甲萘醌 分析標(biāo)準(zhǔn)品

T7 DNA Polymerase芐叉酮 ≥99%亞硫酸氫鈉甲萘醌 95%

T4 RNA Ligase甲基烯酸二甲氨乙酯 99%煙酰胺 99%

T4 DNA Ligase帕莫酸 97%四氯苯醌 98%

TDT氣相過濾器  G1544-80530四螨 分析標(biāo)準(zhǔn)品，98.6%

RAPD Primer蘇丹 Biological stain3,3’-二沒食子酸酯茶黃素 分析標(biāo)準(zhǔn)品, ≥98.0% (HPLC)

Random primers4-(磺酸) 97%二硫化四甲基秋蘭姆 97%

β-Dextranase芐基 99%二硫化四甲基秋蘭姆 分析標(biāo)準(zhǔn)品

2,2,4,4,5,5-六氯聯(lián)苯(標(biāo)準(zhǔn)品)Histone H4 (L64C1) Mouse mAbNT5C2  胞漿-5´-核苷酸酶-Ⅱ抗體

環(huán)氧烷(標(biāo)準(zhǔn)品)Histone H4 (L64C1) Mouse mAbNT5C1A  胞質(zhì)5'核苷酸酶1A抗體

芘(標(biāo)準(zhǔn)品)Helios (D8W4X) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)NT-4/NT-5  神經(jīng)生長因子4/5抗體

苯乙烯(標(biāo)準(zhǔn)品)Cyclin D3 (DCS22) Mouse mAbNT-3 proprotein  神經(jīng)營養(yǎng)因子-3前蛋白抗體

苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml)Cyclin D3 (DCS22) Mouse mAbNT-3  神經(jīng)營養(yǎng)因子3抗體

(-)-鹽酸東莨菪堿(標(biāo)準(zhǔn)品)TP/ECGF1 AntibodyNT/NTS1/NTRH  神經(jīng)降壓素抗體

硫標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000ug/ml，基體:1%HCl)Akt1 (C73H10) Rabbit mAbNSPL2/RTN3  神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白2抗體

質(zhì)二氧化硫(甲法)（劑）標(biāo)樣(溶劑：0.4-0.6mg/L,分析標(biāo)準(zhǔn)品)Akt1 (C73H10) Rabbit mAbNSP5  核結(jié)構(gòu)蛋白5抗體

十四烷(標(biāo)準(zhǔn)品)p58IPK (C56E7) Rabbit mAbNSP1/SH2D3A  SH2結(jié)構(gòu)域蛋白3A抗體

三氯乙烯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,溶劑：甲)TNFRSF17/BCMA (E6D7B) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)NSMase2  中性鞘磷脂2抗體
木霉屬通用PCR檢測試劑盒廠家白介素-1受體相關(guān)激酶4抗體Dendocarbin A中文名：別名：分子式：C15H22O3

干擾素調(diào)節(jié)因子4抗體Pterosin D中文名：蕨素D別名：分子式：C15H20O3

整合素αX抗體Drim-7-ene-11,12-diol acetonide中文名：別名：分子式：C18H30O2

整合素αV抗體Epipterosin L中文名：別名：分子式：C15H20O4

白介素-17D抗體Humulene epoxide II中文名：別名：6,7-Epoxyhumula-2,9-diene分子式：C15H24O
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。