?
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
L-Homoserine3-(環(huán)已胺)-1-磺酸 ≥98.0%0.95

D-allo-Isoleucine3-(環(huán)己胺)-1-磺酸 超純級(jí) 分析標(biāo)準(zhǔn)品，95%

Aspartame3-(環(huán)已胺)-2-羥基-1- 99%黃豆苷原 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

FMOC-C13-(環(huán)已胺)-2-羥基-1- 99.5%黃豆苷原 98%

TBTU3-氯-2-羥基磺酸鈉  95%靛玉紅 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥95%

Amimethyl resin3-[(3-膽固氨基)二甲基氨基]-1-磺酸 98%靛玉紅 95%

2-Chlorotrityl chloride resin2-環(huán)己胺基乙磺酸 ≥99.5% (T)鬼臼毒素 98%

Hydroxymethyl resin2-環(huán)己胺基乙磺酸 ≥99.0% (T)鬼臼毒素 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%

MBHA resin分子生物學(xué)級(jí)利血平 ≥99.0% (HPLC)

Merrifield resin3-[(3-膽固氨基)二甲基氨基]-2-羥基-1-磺酸 99%東莨菪堿酸鹽 98%

Polystyrene resin3-(二丁氨基)胺 97%粉防己堿 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

Rink-Amide resin十二烷基*基氯化銨 99%維生素D3 98%

Rink Amide AM resin十二烷基*基氯化銨 99%，離子對(duì)色譜級(jí)維生素D3 分析標(biāo)準(zhǔn)品

Trityl chloride resin十二烷基*基溴化銨 99%二茂鐵 99%

Wang resin十二烷基*基溴化銨 for ion pair chromatography, ≥99.0%草酸二甲酯 CP，98%

Dopamine hydrochloride3-磺基十六烷基二甲甜菜堿 98%草酸二甲酯 GR，99%

磷酸二氫銨（分析標(biāo)準(zhǔn)品,用于凱氏定氮法氮測(cè)定,≥99.5%）5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAbORP150  氧氣調(diào)節(jié)蛋白150抗體

磷酸二氫銨(for HPLC,≥99.0%(T))Syntaxin 6 (C34B2) Rabbit mAbOrosomucoid 2  類粘蛋白2抗體

Amberlite XAD7HP 離子交換樹脂(Mesh 20-60)Syntaxin 6 (C34B2) Rabbit mAbOrexin-A  增食欲素A/欲激素A

Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂(粒徑0.49 - 0.69 mm)MEK1/2 (D1A5) Rabbit mAb (PE Conjugate)ORAV1  口腔癌高表達(dá)的蛋白1抗體

乙(梯度色譜級(jí), ≥99.9%)Bcl-2 Antibody (Human Specific)Orai2  跨膜蛋白Orai2抗體

無乙(無級(jí), 99.9%,H2O≤10ppm)Bcl-2 Antibody (Human Specific)OPN/BSP  骨橋蛋白抗體(分泌型磷蛋白1)人

無乙(H2O:20-30ppm)ATM (D2E2) Rabbit mAbOPN/BSP  骨橋蛋白抗體(分泌型磷蛋白1)

無乙(無級(jí), 99.8%,H2O：30-50ppm)ATM (D2E2) Rabbit mAbOPGL/RANKL/ODF  骨保護(hù)蛋白配體抗體(破骨細(xì)胞分化因子)

茴香烯(分析標(biāo)準(zhǔn)品，用于萜烯分析，≥99.5% (GC))Phospho-Bcl-2 (Thr56) Antibody (Human Specific)OPG  骨保護(hù)蛋白/護(hù)骨素抗體

4-氨基-3-(三氟甲基)苯甲(98%)Phospho-Bcl-2 (Thr56) Antibody (Human Specific)OPCML  阿片樣物質(zhì)結(jié)合蛋白/細(xì)胞粘附分子樣蛋白抗體
文氏密螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒廠家4-Bromobenzenesulfonyl chloride, ≥98.0%通用試劑　25G

α-Bromoisobutyryl bromide ,≥98.0%通用試劑　25G

Isophthaloyl chloride ,≥99.0%通用試劑　100G

2-Bromopropionyl bromide ,≥97.0%通用試劑　25G

Bromoacetyl bromide ,≥97.0%通用試劑　25G

Trimethylacetyl chloride,≥98.0%通用試劑　100ML

Cinnamoyl chloride通用試劑　25G

Tetrahydrofurfuryl chloride通用試劑　25G

Methyl chlorooxoacetate通用試劑　5G

Methacryloyl chloride ,≥95.0%通用試劑　25G

Trifluoromethanesulfonyl chloride,≥99...通用試劑　5G

3-(Trifluoromethyl)benzoyl chloride ,...通用試劑　5G

2-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl chlorid...通用試劑　1ML

3-Nitrobenzenesulfonyl chloride通用試劑　5G

2-Nitrobenzoyl chloride ,≥96.0%通用試劑　5G