注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Clostripain from Clostridium histolyticum二苯甲酮 99%草酸 CP，99.5%

E-64吡啶-2，3-二羧酸 99%草酸 GR，99.8%

Kallikrein from porcine pancreas吡啶-2，5-二羧酸 98%草酸 SP

Luciferase from Bacteria吡啶-3，5-二羧酸 98%草酸 99.99% metals basis

Luciferase firefly2,6-吡啶二羧酸 99%草酸 ACS

Maltose Phosphorylase聚四氟乙烯微粉 平均粒徑: 5μm草酸 Standard for GC，≥99.6%

Microcococcus lysodeikticus cells葡萄糖 AR草酸 ≥99.998% (metals basis)

Mutarotase甘露 AR,98.0%草酸 ≥99.9999% (metals basis)

Phosphodiesterase I from Crotalus adamanteus vem甘露  超純級(jí)，≥99.0%(HPLC)4-溴苯磺酰氯 98%

Phosphodiesterase II from bovine spleen甘露 ≥99.9999% metals basis3-環(huán)己基酸 99%

PLA2甘露 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>99.9999%上光油鐵罐(直徑127mm*250mm)

PAO甘露  藥用級(jí)，符合EP, FCC, USP上光油鐵罐 直徑73mm*高度150mm

 Protease S AureusD-山梨 AR,98.0%天然黃蜂蠟 醫(yī)藥級(jí)（CP2005版）

UTID-山梨 用于細(xì)胞培養(yǎng)，≥98%蜂蠟 46-60°C

COMT雌三 USP蜂蠟 62-67°C

Irganic Pyrophosphatase雌酮 97%天然白蜂蠟 醫(yī)藥級(jí)（CP2005版）

叔丁胺(standard for GC,≥99.5%(GC))iS Antibody (Mouse Specific)tch1/MOTC  跨膜受體蛋白tch-1抗體

2,3-丁二酮(standard for GC,≥99.0%(GC))mTOR (7C10) Rabbit mAbtch 2  跨膜受體蛋白tch-2抗體

癸二酸二辛酯（DOS）(Standard for GC, ≥98.5% (GC))mTOR (7C10) Rabbit mAbS-3/eS  一氧化氮合成酶-3抗體（內(nèi)皮型）

溴代正丁烷(Standard for GC,>99.5%(GC))Lck (D88) XP® Rabbit mAbS-2/iS  一氧化氮合成酶-2抗體（誘導(dǎo)型）

正丁硫(standard for GC,≥99%(GC))Lck (D88) XP® Rabbit mAbS-2/iS  一氧化氮合成酶-2抗體（誘導(dǎo)型）

乙酸仲丁酯(standard for GC, ≥99.5% (GC))Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate)nylphel  壬基酚抗體

甲酸丁酯(Standard for GC)CNPase Antibodynstructural protein 1/NS1  A型流感病毒-NS1抗體（神經(jīng)氨酸酶1）

一正丁胺(Standard for GC,≥99.7%(GC))Transthyretin (D8T4Q) Rabbit mAbn-muscle Myosin IIA  非平滑肌肌球蛋白2A抗體

仲丁(Standard for GC,≥99.8%(GC))RANTES (R40) AntibodyL8  核仁蛋白8抗體

聯(lián)苯(Standard for GC,>99.5%(GC))RANTES (P20) AntibodyL1  增殖相關(guān)核仁抗原抗體
馬毛癬菌PCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格宿主細(xì)胞因子1抗體Enmein中文名：延命素別名：延命草素分子式：C20H26O6

組蛋白H2A/S抗體Carpalasionin中文名：別名：分子式：C22H28O8

HDHD1蛋白抗體Excisanin A中文名：別名：分子式：C20H30O5

HDHD2蛋白抗體rcaesalpinin E中文名：別名：17-rbonducellpin C分子式：C21H28O6

羥基酰谷胱甘肽解酶樣蛋白抗體Tispiside C中文名：別名：分子式：C27H36O12
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。