PCR擴(kuò)增試劑盒在實(shí)驗(yàn)時的幾點(diǎn)事項(xiàng)解析

更新時間：2021-07-08

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　　PCR擴(kuò)增試劑盒提供DNA高保真擴(kuò)增所需要的基本試劑。DNA擴(kuò)增時，用戶需要自行準(zhǔn)備模板和擴(kuò)增所需要的引物。高溫嗜熱Pfu DNA聚合酶主要用于對保真度要求非常高的DNA擴(kuò)增，這些擴(kuò)增要求擴(kuò)增的產(chǎn)物中不能出現(xiàn)突變等錯誤。Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增性能很強(qiáng)，但是用Taq擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中有難以避免的隨機(jī)突變。Pfu DNA聚合酶除了5′-3′的聚合特性外，還有3′-5′端外切酶活性，具有校正DNA擴(kuò)增過程中突變。Pfu DNA的長片段擴(kuò)增的能力不及Taq DNA聚合酶，用戶如果用于長鏈PCR擴(kuò)增，可選用Long Taq或者Taq Plus DNA聚合酶。

　　PCR擴(kuò)增試劑盒的實(shí)驗(yàn)事項(xiàng)說明：

　　1.樣本上多重PCR平臺可以做的樣本包括血液、唾液、口腔拭子，在實(shí)驗(yàn)中，對于DNA投入量要求不是很高，根據(jù)不同項(xiàng)目需求，DNA投入量的范圍在100 pg-100 ng之間。

　　2.進(jìn)行PCR反應(yīng)前可將所有g(shù)DNA的濃度稀釋到同一濃度，并轉(zhuǎn)移到PCR八聯(lián)管中，一方面是便于排槍操作，另一方面是加入相同起始量的gDNA，這樣可降低最終文庫的濃度差異，便于混合文庫。

　　3.大多數(shù)情況下引物是一管，操作相當(dāng)方便；當(dāng)目標(biāo)區(qū)域是外顯子或者是其他連續(xù)區(qū)域時，我們會把引物分裝為二管，分別命名Primer pool T1與Primer pool T2，這時需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并，再進(jìn)行下一步反應(yīng)。

　　4.執(zhí)行多重PCR反應(yīng)時，特別是樣本量多的情況下，可以將T1設(shè)為一組，T2設(shè)為一組，便于制備反應(yīng)試劑混合液和排槍操作；并把解凍好的試劑放置在冰盒上，在冰盒上進(jìn)行加樣操作。

　　5.實(shí)驗(yàn)中可在PCR管壁上和管蓋上同時進(jìn)行反應(yīng)編號標(biāo)記，防止高溫或其他原因?qū)е掠浱栂?，避免后續(xù)產(chǎn)物混合操作失誤，造成樣本交叉污染。

　　6.第二輪PCR后，因?yàn)锽試劑比較粘稠，在清洗純化的時候不能吸走所有試劑，可以剩余5-10μl，否則會把磁珠一起吸走，造成樣品的損失，導(dǎo)致產(chǎn)物回收率下降。

　　實(shí)驗(yàn)完成后，正常文庫濃度處于5-30 ng/μl，而片段長度一般在280-460 bp之間，且主峰前后無雜峰，就可以進(jìn)行測序了。