細(xì)胞凋亡陽(yáng)性對(duì)照試劑盒操作程序：

注意：最重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過(guò)度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。

1．玻片的處理：一般采用多聚賴(lài)氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．細(xì)胞在多聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。

3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。

8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專(zhuān)用蓋玻片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過(guò)夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

13.滴加化過(guò)氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。

16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。

本試劑盒含有兩種不同的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑，試劑A和試劑B。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑A(Apopida)和試劑B(Apobid)分別可以誘導(dǎo)Hela、HEK293、CHO、COS等常見(jiàn)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。

由于細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)具有細(xì)胞特異性，細(xì)胞凋亡的機(jī)制也具有一定的細(xì)胞特異性，盡管細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑A和試劑B可以誘導(dǎo)常見(jiàn)的一些細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，但是我們無(wú)法保證這兩種試劑可以誘導(dǎo)任何一種細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑A和試劑B相互補(bǔ)充，可以誘導(dǎo)更多種類(lèi)的細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。本試劑盒至少可用于檢測(cè)200個(gè)樣品。

高密度聚乙烯Polyethylene, High Density9002-88-4

L-焦性麩質(zhì)酸;L-焦性膠氨酸;L-2-吡咯烷酮-5-羧酸L-PyroglutaMic acid;L-GlutiMinic acid;GlutiMic acid;GlutaMic acid lactaM;α- AMinoglutaric acid lactaM;L-5-Oxo-2-pyrrolidine carboxylic acid;(S)-(-)-2-Pyrrolidone-5-carboxylic acid98-79-3

L-異赤絲藻氨基酸L-Threonine;L-β-Hydroxy-2-aMinobutyric acid;(2S,3R)-2-AMino-3-hydroxybutyric acid;(2S,3R)-(-)-Threonine72-19-5

L-甲狀腺素鈉;L-甲狀腺胺鈉;3,5,3′,5′-四碘甲狀腺-L-原氨L-Thyroxine sodiuMsalt;3,3′,5,5′-Tetraiodo-L-thyronine sodiuM salt pentahydrate;SodiuM levothyroxine;Levothyroxine sodiuM;Eltroxin;Thyroxevan;25416-65-3

L-甲狀腺素;3,5,3′,5′-四碘-L-甲狀腺原氨酸;3-[4-(4-羥基-3,5-二碘苯氧基)-3,5-二碘苯基]-LL-Thyroxine;3-[4-(4-Hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]-L-alanine;β-[(3,5-Diiodo-4-hydroxyphenoxy)-3,5-diiodophenyl]-L-alanine51-49-0

;L-β-對(duì)羥苯基-α-氨基丙酸;L-干酪氨基酸L-Tyrosine;(S)-2-AMino-3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid;3-(4-Hydroxyphenyl)-L-alanine;L-α-AMino-β-p-hydroxyphenylpropionic acid;L-α-AMino- p-hydroxyhydrocinnaMic acid60-18-4

淋巴細(xì)胞分離液LyMphocyte separation Media;

麥康凱瓊脂;麥康克瓊脂Mac Conkey agar;

氟化鎂MagnesiuM fluoride;Afluon;Sellaite7783-40-6

MagnesiuM Hydroxide (AS);Marinco H1309-42-8

MagnesiuM Stearate (AS);DoloMol577-04-0

MagnesiuM trisilicate;MagnesiuM silicate;MagnesiuM Mesotrisillicate14987-04-3

蘋(píng)果酸Malic Acid;4455-77-0

丙二酰胺MalonaMide;PropanediaMide;108-13-4

丙二腈 99％Malonic acid141-82-2

丙二腈;氰化亞甲基;二氰甲烷;氰基乙腈;縮蘋(píng)果腈Malonitrile;Methylene cyanide;DicyanoMethane;CyanoacetonitrileMandelic Acid (AS);α-Hydroxyphenylacetic acid;Phenylhydroxyacetic acid;Phenylglycolic acid;α-Hydroxybenzeneacetic acid;dl-Mandelic acid90-64-2

Manganese Chloride (AS)7773/1/5